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常见问题

DNA提取量少的原因?

DNA提取量少的原因很多,归结主要有如下几个方面:

实验材料不佳或量少、破壁或裂解不充分、沉淀不完全或洗涤时DNA丢失

a.尽量选用新鲜的材料;b.研磨充分,不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存,以免DNA降解。c.低温沉淀,延长沉淀时间;d.加辅助物,促进沉淀;e.洗涤时,最好用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒。

● 样品破壁或裂解不完全,DNA未充分释放

材料应在液氮中充分研磨匀浆。

● 样品量过多导致细胞裂解不充分:

加样量过多使裂解液和样品混合不均匀,细胞裂解不充分。不同来源样品的加样量请参见所使用试剂盒的要求标准。

● DNA吸附不充分

如在上吸附柱前未加无水乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇,则导致DNA不能充分沉淀,与硅胶膜吸附不彻底,因此应在样品裂解后加适量无水乙醇,再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。

● DNA洗脱不适当

洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来,应确保洗脱液pH值在7.0~8.5之间。洗脱体积过少,若小于30µl,不易完全浸透硅胶膜,使DNA不能全部洗脱下来,因此洗脱缓冲液应大于30µl。同时如洗脱体积过大,超过200µl,则所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少。洗脱时可将洗脱缓冲液在65~70℃水浴预热,加入洗脱液后在室温静置2~5分钟,可提高洗脱效率,加大DNA产量。

● 提取的基因组DNA有降解

a.选取的材料不新鲜或反复冻融,采集材料后未及时处理或未低温保存:

b.未能有效抑制内源核酸酶作用:

某些DNase含量较丰富的组织样品应在液氮中研磨或匀浆,研磨过程中应随时补充液氮,并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。

c.操作过于剧烈导致DNA被机械打断:

预处理的样品加入细胞裂解液后,所有操作应尽量柔和,避免振荡、搅拌等剧烈机械力对DNA片段的损伤。

● DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应

可能原因: a.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质;b.DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应;c.DNA中残留有金属离子。

处理办法:a.重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质;b.重新沉淀DNA,让酒精充分挥发;c.增加70%乙醇洗涤的次数(2~3次)。

PCR产物应多长时间以内做电泳检测?

一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。

PCR过程中出现的假阴性或者不出现扩增条带的原因?

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量,④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序应固定不宜随意更改。

酶失活:需更换新酶或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴化乙锭。

引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释 引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20µl、30µl、50µl,或100µl。应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20µl后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。

物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。

序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

造成假阳性出现的原因是什么?

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

PCR扩增为什么会出现非特异性扩增带?

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸),避免出现片状拖带或涂抹带。

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因?

由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:

①减少酶量,或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量,减少循环次数。

Real-time PCR无CT值(信号)出现的原因?

1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45 cycles),但高于45个循环会增加过多的背景信号;

2.检测荧光信号的步骤有误。一般染料法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号;

3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性;

4.引物或探针的设计,如探针高于引物的温度不够,造成探针未杂交上而产物已延伸的情况;

5.模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;6.模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Real-time PCR CT值为什么会出现过晚?

1.扩增效率低,设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等;

2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

3.PCR产物太长,一般采用80~150bp的产物长度。

Real-time PCR的标准曲线为什么线性关系不佳?

1.加样存在误差,使得标准品不呈梯度;

2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品;

3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针;

4.模板中存在抑制物,或模板浓度过高。

Real-time Real-time PCR阴性对照出现明显的起飞的原因?

1.反应混合物或水被污染;

2.引物二聚体的出现,用染料法法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况,可配合熔解曲线进行分析;

3.反应过程中探针的降解,用PAGE电泳对探针进行检测;

4.如果使用了ROX校正,则可能是ROX的降解所造成。

Real-time Real-time PCR扩增效率低的原因?

1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解;

2.反应条件不够优化,可适当降低退火温度或改为三步扩增法;

3.反应体系中有PCR反应抑制物,一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

为什么有时Real-time PCR实验重复性不好?

1.加样不准确;

2.仪器在样品上温度条件有差异,即温度均一性不好;

3.模板浓度低,样品初始浓度越低,重复性越差,应减少样品的稀释倍数。

Real-time PCR的变性时间多长?

15到20秒对于变性扩增子是足够了,长一点的产物可能会需要30秒,60秒的变性时间通常是不需要的。

Real-time PCR退火温度和时间是多少?

检查引物和探针的Tm值,SYBR Green I的退火时间大约20到35秒,双标记探针通常是两步法,退火和延伸合并为一步,时间大约是45到60秒,温度通常在60℃,对于FRET探针退火步骤大约20到30秒。

Real-time PCR在哪一步骤采集信号?

SYBR GreenI应当在72℃,此时绝大部分的DNA是双链状态,如上所述,双标记探针通常是两步检测,因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。对于FRET检测,数据应该在退火步骤检测。如果对于信号采集点不确定,可以多点采集作对比。如果监控屏幕检测不到信号,检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。

Real-time PCR如何选择合适的增益值?

一些情况下会看到曲线超过了窗口范围,在荧光强度100的地方成一直线。尽管大部分的数据可以用,但是减少增益,一些原始数据就不会超出范围。有时,在第一个循环信号就跳出了窗口范围,这是由于增益选得太高,看起来像没有检测到数据。如果熔解曲线分析时,开始荧光就达到了100,则应当用低的增益重新运行,而不需要重新运行扩增反应,SYBR GreenI和FRET的样品可以在一定程度上反复使用。